聚乙二醇主鏈ELISA試劑盒使用說明書
聚乙二醇主鏈ELISA試劑盒使用說明書
用于測量聚乙二醇和聚乙二醇結合蛋白的ELISA試劑盒
PEG
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EC50 (ng/ml)
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BSA-(mPEG 20 kDa)3-7
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1.0 +/- 0.1
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BSA-mPEG 20 kDa
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3.6 +/- 0.5
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BSA-PEG 10 kDa
|
9.4 +/- 1.1
|
BSA-mPEG 5 kDa
|
111 +/- 22
|
20 kDa mPEG
|
0.70 +/- 0.15
|
10 kDa PEG
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0.59 +/- 0.16
|
5 kDa mPEG
|
4.65 +/- 2.32
|
- 涂布聚乙二醇的 Microtiter 96孔板 (12 條8孔可拆卸板條)。-20℃下保存。
- HRP結合抗聚乙二醇抗體, 1 小瓶。 -20℃下保存。
- HRP結合聚乙二醇稀釋劑, 50 ml
- PEG-BSA標準品, 1小瓶。* -20℃下保存。
- HRP PEG洗滌緩沖液 (20x stock), 50 ml
- TMB試劑, 11 ml
- 終止液, 11 ml
- 精密移液器和吸頭
- 蒸餾水或去離子水
- 聚丙烯管或玻璃管
- 漩渦混合器
- 吸水紙或紙巾
- 微孔板培養箱/振蕩篩 (混合速率 ~150 rpm)
- 洗板機
- 讀板器,450nm下光密度范圍0-4
- 繪圖軟件
- 將8個聚丙烯管或玻璃管分別標記為1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064 和0 ng/ml。
- 按照PEG標準品小瓶標簽上的方法制備1000 ng/ml標準溶液。
- 分別將200μl稀釋液加入標有200、40、8、1.6、0.32、0.064和0 ng/ml的試管中。
- 將1000 ng/ml的PEG標準溶液用移液器轉移50 μl轉移至標有200 ng/ml的試管中并混合均勻。由此獲得 200 ng/ml PEG-BSA 工作標準溶液。
- 依次進行類似的5倍稀釋可分別制備40, 8, 1.6, 0.32 和 0.064 ng/ml的標準溶液。
- 確保涂布板孔的數量足夠用。
- 將50μl標準品和樣品加入孔內(建議標準品和樣品一式三份進行測試)。
- 向每個孔中加入50μl的HRP結合抗-PEG抗體。
- 在室溫(25°C)下,以150轉/分的速率在微型平板振動篩上培養1小時。
- 使用洗板機,用400μl清洗緩沖液清洗板孔共6次。
- 用吸水紙或紙巾充分擦拭板孔,以去除殘留液滴。
- 將100μl TMB試劑加入各個板孔。
- 以150轉/分的轉速在微板振動篩上輕輕混合20分鐘。
- 加入100μl終止溶液到每個板孔,來停止反應。
- 輕輕混合,直到所有藍色變成黃色。
- 在5分鐘內用孔板讀數器讀取450 nm處的吸光度。
- 計算每組參考標準品和樣品的吸光度平均值(A450)。
- 通過測得的每個參考標準品的平均吸光度,與其濃度以10為底的對數log10(ng/ml)的比值,繪制標準曲線,垂直軸或Y軸為吸光度,水平軸或X軸為濃度。
- 將數據擬合到Sigmoidal函數量效關系模型(可變斜率)。曲線上限可以用0 ng/ml空白標準品測定值修正,曲線下限可以用1000 ng/ml標準品的測定值修正。
- 根據每個樣品的平均吸光度值,從標準曲線中得到相應聚乙二醇化蛋白質以10為底的對數濃度,并通過逆以10為底對數計算得出濃度(ng/ml)。
- 強烈建議僅使用標準曲線中間50%范圍內的樣品吸光度值來確定PEG濃度。例如,如果吸光度的下限(0 ng/ml)和上限值分別為1.6和0.1,則僅采用位于1.225和0.475范圍內的樣品吸光度值。
- 用推導出的濃度乘以稀釋因子,以確定血清/血漿樣本中聚乙二醇化蛋白質的實際濃度。
- 如果樣品的A450值超出標準曲線的有效范圍,則應適當稀釋樣品并重新測試。
- 切勿將疊氮鈉作為防腐劑添加到血清或血漿樣本中。疊氮化物是HRP的抑制劑,會使分析無效。
推薦使用洗板機用于微孔板清洗。僅使用試劑盒提供的清洗緩沖液。在使用前用蒸餾水或去離子水洗滌洗板機所有的管道和器皿,并用清洗緩沖液徹底洗滌。 - 制備標準品時,通常使用多道移液器在空白聚丙烯96孔板上進行恰當的連續稀釋操作。樣品也同樣制備,并/或分配到空白96孔板用于酶聯免疫的位置。這樣使用多道移液器可保樣品和標準品快速簡便地轉移到酶聯板上。
- 如使用試劑盒之外的標準品,建議使用10倍稀釋液來確定標準曲線范圍,從10 μg/ml濃度開始。 使用單條8孔板條,可毫不費力地確定從0.1 ng/ml到10 μg/ml 濃度范圍。然后通過微調獲得可用的標準曲線范圍。
- 所有試劑在使用前必須達到室溫(18-25攝氏度)。
- 在添加HRP結合抗PEG抗體之前,始終先將樣品和標準品添加到微孔中。
- 請勿使用自備緩沖液替代試劑盒提供的緩沖液(例如稀釋液或洗滌緩沖液)。許多市售材料含有聚乙二醇或聚乙二醇結合分子,這將影響試劑盒的性能。因此,應小心選擇用于聚乙二醇結合蛋白研究的其他組份。
- 吐溫-20是一種含有聚氧乙烯的洗滌劑,常用于ELISA稀釋和洗滌緩沖液。它會干擾本酶聯免疫吸附試驗盒。其他聚氧乙烯洗滌劑亦如是。
- 不要把疊氮化物作為防腐劑添加到血清或血漿樣本中。疊氮化物是HRP的抑制劑,會使分析無效。
- 強烈推薦使用洗板機清洗微孔。務必使用試劑盒附帶的清洗緩沖液。使用前用蒸餾水或去離子水清洗洗板機的所有管路和容器,并用清洗緩沖液徹底清洗洗板機。
- 制備標準品時,通常使用多道移液器在空白聚苯乙烯96孔板中進行適當的連續稀釋。樣品制備和/或分配到在ELISA中預置的空白96孔板中。使用多道移液器將樣品和標準品快速簡便地轉移到ELISA板上。
- 如采用試劑盒預置以外的標準品,建議使用10倍稀釋液來確定標準曲線范圍,起始濃度從10μg/ml開始。使用單個8孔板條,濃度范圍0.1 ng/ml至10μg/ml的檢測會更便宜些。然后再微調標準曲線范圍。

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